Efecto del glicerol sobre la catálisis por fosfatasa ácida de bajo peso molecular de hígado de alpaca (lama pacos) / Effect of glycerol on catalysis by low molecular weight acid phosphatase from alpaca liver (lama pacos)

Objetivo: Determinar el efecto del glicerol sobre la hidrólisis del p-nitrofenil fosfato a pH 5,0 por fosfatasa ácida de bajo peso molecular de hígado de alpaca. Diseño: Estudio analítico experimental. Lugar: Centro de Investigación de Bioquímica y Nutrición, Facultad de Medicina, Universidad Nacional Mayor de San Marcos. Materiales: Se utilizó los reactivos químicos p-nitrofenil fosfato sal disódica, ácido acético glacial, glicerol, ácido tricloroacético, ácido sulfúrico, molibdato de amonio, ácido ascórbico, sulfato de amonio, sephadex G-75 (45-120), sulfoetil sephadex C-50 y etilendiaminotetraacético (EDTA). Métodos: Se determinó los parámetros cinéticos Km y Vmax utilizando como sustrato el p-nitrofenil fosfato, en presencia de concentraciones variables de glicerol. Así mismo, se determinó la velocidad de liberación de los productos de la reacción en función de la concentración de dicho nucleófilo. Principales medidas de resultados: Efecto del glicerol sobre la hidrólisis del p-nitrofenil fosfato. Resultados: El glicerol en concentraciones comprendidas entre 1,16 y 3,49 M incrementó linealmente la liberación del p-nitrofenol; en cambio, la formación del fosfato inorgánico -el segundo producto liberado- no se modificó. Así mismo, los valores de Km y Vmax se incrementaron linealmente dependientes de las concentraciones de glicerol, en un rango comprendido entre 0,58 y 2,32 M. Conclusiones: Un análisis de las modificaciones que ejerce el glicerol sobre los valores de Km y Vmax y la velocidad de liberación de los productos de la reacción permite sugerir un modelo en el que la fosfatasa ácida de bajo peso molecular de hígado de alpaca cataliza la hidrólisis de fosfomonoésteres a través de un mecanismo uni biordenado, con la formación de un complejo enzima-fosfato, que sería escindido por agua o un nucleófilo, como el glicerol; en este modelo a k2 le corresponde un valor mucho mayor que k3 y k4 N.

Objective: To determine the effect of glycerol on hydrolysis of p-nitrophenyl phosphate at pH 5,0 by low molecular weight acid phosphatase from alpaca liver. Design: Experimental analytical study. Setting: Biochemistry and Nutrition Research Center, Faculty of Medicine, Universidad Nacional Mayor de San Marcos, Lima, Peru. Materials: Disodic p-nitrophenyl phosphate salt, glacial acetic acid, glycerol, tricloroacetic acid, sulfuric acid, ammonium molibdate, ascorbic acid, ammonium sulphate, sephadex G 75 (45-120), sulpho ethyl sephadex C-50 and ethylene diaminotetraacetic (EDTA) chemical reactives. Methods: Both Km and Vmax kinetic parameters were determined with p-nitrophenyl phosphate as substrate in presence of different concentrations of glycerol. The rate of formation of products was determined as a function of the concentration of such nucleophile. Main outcome measures: Glycerol effect on p-nitrophenyl phosphate hydrolysis. Results: Glycerol linearly increased pnitrophenol release at concentrations between 1,16 and 3,49M. Instead, inorganic phosphate formation, the second product, was not modified. Also, Km and Vmax values increased linearly between 0,58 and 2,32 M depending on glycerol concentrations. Conclusions: Analysis of modifications induced by glycerol on Km and Vmax values as well as on liberation velocity of the reaction products suggests a model in which low molecular weight acid phosphatase isolated from alpaca liver catalyses phosphomonoesters hydrolysis through an uni biordered mechanism, with formation of an enzyme phosphate complex that will be splitted by water or a nucleophile such a glycerol; in this model, k2 corresponds to a much higher value than k3 or k4 N.

Mecanismo de acción de las fosfatasas ácidas de bajo peso molecular / Mechanism of action of low molecular weight acid phosphatases

Las fosfatasas ácidas son enzimas ampliamente distribuidas en la naturaleza y tienen la propiedad de hidrolizar fosfomonoésteres a pH 5,0, liberando como productos de la reacción un alcohol y fosfato inorgánico. Cuando se compara los valores de kcat/Km de las fosfatasas de hígado, de bovino, alpaca y porcino, nos permite sugerir que estas enzimas tienen elevada afinidad por el sustrato p-nitrofenil fosfato. Los productos que se liberan durante la catálisis por fosfatasa ácida, muestran que el fenol o el p-nitrofenol se comportan como inhibidores de tipo no competitivo, mientras que el fosfato inorgánico muestra una inhibición de tipo competitiva. Para evidenciar laprobable formación de un complejo covalente en la secuencia catalítica, se utilizó diversos nucleófilos más eficientes que el agua, tales como metanol, etanol y glicerol. Las modificaciones que produjeron en los valores Km, Vmax y los productos liberados en la reacción sugieren la formación de un complejo enzima-fosfato. El pH afecta los valores de Km y Vmax de las fosfatasas ácidas, un análisis del comportamiento de estas enzimas en un rango de pH comprendido entre 3,8 y 6,8 sugieren que en el sitio activo existe un residuo de aminoácido con un valor pKa de 6,0. El uso del dietilpirocarbonato, un compuesto que selectivamente reacciona con el residuo histidina en las proteínas, inhibe completamente a estas fosfatasas. Así mismo, un experimento de cinética de inhibición múltiple realizado en presencia de fosfato inorgánico y dietilpirocarbonato permite calcular un valor Ki que es igual al obtenido en otras condiciones experimentales. En tal sentido, las fosfatasas ácidas de bajo peso molecular catalizarían las reacciones a través de un modelo de tipo uni biordenado, con la formación de un complejo covalente intermedio, y que el residuo histidina participaría directamente en la catálisis.

Acid phosphatases are enzymes widespread in nature that hydrolyze phosphomonoesters at pH 5,0; this reaction yields alcohol and inorganic phosphate. Comparison of bovine, alpaca and porcine liver phosphatases kcat/Km values suggests these enzymes have a high affinity for p nitrophenyl phosphate substrate. Products that are released during acid phosphatase catalysis show that phenol or p nitrophenol behave as non competitive inhibitors, whereas inorganic phosphate shows competitive inhibition. Different nucleophiles more efficient than water have been used, such as methanol, ethanol and glycerol, showing the probable formation of a covalent complex in the catalytic sequence. Modifications produced in Km and Vmax values as well as in the reaction released products suggest the development of an enzyme-phosphate complex. pH affects acid phosphatases Km and Vmax values. Behavioral analysis of these enzymes at 3,8 to 6,8 pH range suggests the location of a pKa 6,0 aminoacid residue in the active site. The use of a diethylpyrocarbonate compound which selectively reacts with protein histidine residues completely inhibits this kind of phosphatases. Also, multiple inhibition kinetic survey performed in presence of inorganic phosphate and diethylpyrocarbonate allows a Ki value calculation equal to that obtained in other experimental conditions. In this respect, low molecular weight acid phosphatases would catalyze reactions through a uni biordered model, forming an intermediate covalent complex; histidine residues would directly participate in the catalysis.